Sobre el  CRISPR-CAS9

Hace unos años saltó a la fama un sistema de edición genética que ya era muy comentado en los círculos de los entendidos. Desgraciadamente, fue el experimento de un científico chino lo que lo puso en boca de todos, convirtiendo al CRISP-CAS9 en otro famoso desconocido.

¿Qué es el CRISP-CAS9? Vamos a comentarlo.

¿Qué es y cómo funciona?

CRISP son las siglas de clustered regularly interspaced short palindromic repeats, que se ha traducido al castellano como “repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas”. Fue descubierta por primera vez en los 90 por el microbiólogo Francisco Martínez Mojica cuando se percató de la relevancia de ciertas repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciada que descubrió en los genomas de arqueas y que más tarde se descubrieron en bacterias.

En resumen, se podrían definir como “autovacunas” utilizadas por bacterias y arqueas frente virus y plásmidos. Cuando un virus ataca a una célula procariota, inyecta su ADN y pequeños fragmentos de este ADN llamado espaciador de este se incorpora al genoma de la célula huésped en lugares donde se intercalan con secuencias cortas de ADN repetidas. Esto permite a las bacterias grabar bacterias a las que han estado expuestas y, si son atacadas por un virus similar, el ARN copiado o guía se une a una encima CAS especializada y la orienta para que corte la secuencia de ADN viral y lo degrade.

Al ser unicelulares, las bacterias son capaces de trasferir esta inmunidad a sus descendientes y también son capaces de transferirlas a otras por fenómenos de parasexualidad como la conjugación bacteriana.

Se ha descrito como una inmunidad adquirida o adaptativa que “recuerda” las secuencias de ADN patógenos.

En 2005 el propio Mojica predijo que este proceso podría utilizarse para la edición genética. En mayo de ese mismo año en Francia Alexander Bolotin y su equipo descubrieron el sistema de proteínas Cas9, que son capaces de cortar cualquier ADN siempre que se les proporcione un ARN adecuado. De ahí sale el apodo de “tijeras moleculares” para referirse al CRISPR-Cas9.

Y entre 2012 y 2013 los equipos de la francesa Emmanuelle Charpentier, la estadounidense Jennifer Doudna y Feng Zhang descifraron los mecanismos moleculares del sistema de CRISPR-Cas9 dando lugar a una herramienta de edición genética para insertar, suprimir o modificar ADN descrita como sencilla, versátil y potente.

Según Lluís Montoliu, investigador del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, el “CRISPR es una de las tecnologías más robustas que nunca se han descrito en biología”, “Además, es sencilla y barata, y no se necesitan equipos especiales para aplicarla”.

¿Cómo funciona?

Se introduce en la célula un ARN guía sintetizado previamente, que es complementario a la región de ADN que se quiere modificar y se asocia con la enzima Cas9.

Una vez asociado, dirige la enzima hacia el ADN de la célula hospedadora para cortar una región específica.

A continuación actúan los mecanismos naturales de reparación del ADN fragmentado y es entonces cuando se puede silenciar el gen que nos interesa o introducir un fragmento modificado de ADN complementario al ARN guía introducido.

Si en este momento solo se encuentran separadas las dos partes del genoma, interviene un mecanismo de reparación celular que las vuelve a conectar, que a menudo resulta impreciso y puede inutilizar los genes implicados. Cuando el ADN flota libremente en la célula con los cabos sueltos, interviene otro sistema más preciso, denominado reparación de combinación homóloga (HDR), que los vuelve a conectar y da lugar a cambios específicos en el genoma.

Dado que es posible sintetizar artificialmente cualquier secuencia de ARN, esto nos permito cortar cualquier genoma en cualquier lugar y editarlo, al menos en teoría.

De esta forma, el CRISPR-Cas9 permite inhabilitar genes o introducir otros.

¿Cuáles son sus aplicaciones?

Las aplicaciones de esta técnica de edición genética se agrupan en varios campos:

  • Industria alimentaria.
  • Investigación y biotecnología.
  • Cambios ecológicos.
  • Medicina y salud.
  • Edición de embriones.

Vamos a revisarlas por partes.

Industria alimentaria

El CRISPR-Cas9 se utiliza en la agricultura transgénica, permitiendo producir plantas transgénicas con mayor seguridad.

Un ejemplo lo tenemos en el trabajo de un equipo de científicos liderado por el ingeniero agrónomo Sergio Feingold, director del Laboratorio de Agrobiotecnología del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) en Argentina. Focalizaron su investigación en el gen que codifica la polifenol oxidasa, enzima que provoca el oscurecimiento de las patatas al catalizar la oxidación de diferentes compuestos fenólicos con la consecuente trasformación a pigmentos oscuros no deseables para la calidad industrial de la patata.

Tras siete años de trabajo, lograron apagar el gen que codifica la polifenol oxidasa con CRISPR-Cas9 en plantas cuyos tubérculos mostrarán menor grado de oscurecimiento.

De todas formas, aquí hay cierta discusión: se ha discutido que las plantas editadas con CRISPR son transgénicas dado que no se introduce un nuevo gen sino que se modifica uno ya existente.

En EEUU, donde no hay una regulación especial, se ha permitido la comercialización de champiñones que se conservan durante más tiempo. En 2017 la UE no se había pronunciado, con la excepción de Suecia que había determinado que los organismos editados con CRISPR no son organismos modificados genéticamente.

De todas formas, en el sentido de la producción alimentaria se debe tener en cuenta que mucha gente siente recelos ante los productos editados genéticamente y que será necesario un etiquetado muy claro para determinar qué productos han sido editados y cuáles no. Otro reto para los planes de etiquetado (Euroetiquetas) de la Unión Europea.

Cambios ecológicos

En este caso nos referimos a la lucha contra las plagas y el ejemplo más comentado está en la modificación del mosquito Amofeles trasmisor de la malaria, infertilizándolo o haciendo que actúe contra el parásito.

Esto se lograría gracias a una técnica conocida como impulso génico (gene drive) que permite propagar con rapidez ciertos rasgos artificiales en poblaciones de animales silvestres.

En este caso el caso Montoliu advierte que esto podría utilizarse con fines de bioterrorismo o terrorismo industrial. También afirma que estos experimentos podrían romper la selección natural, cosa que yo no veo muy clara.

Medicina y salud

Es en este terreno en el que los potenciales del CRISPR se tornan más importantes pero a la vez polémicos, pues abren la puerta a la ansiada terapia génica.

Una de las opciones se dirige al tratamiento de enfermedades causadas por alteraciones en un solo gen, aunque podría ser beneficiosa en otras muchas. Entre las enfermedades cuyo tratamiento podría beneficiarse podemos mencionar la amaurosis congénita de Leber, la anemia de Fanconi o la distrofia muscular de Duchenne. También se ha mencionado un gen llamado apoE, relacionado con el Alzhéimer.

Los tratamientos en este sentido se realizan exvivo, extrayendo células del enfermo, modificándolas y volviéndolas a inyectar.

En opinión de Marc Güell, de la Pompeu Fabra, uno de los mayores potenciales médicos de la CRISPR-Cas9 está en el desarrollo de órganos y tejidos en cerdos para trasplantarse en seres humanos.

Güell señala que uno de los mayores problemas médicos actuales está en la escasez de órganos disponibles para trasplantes y que la cría de cerdos para ello podía ser la respuesta más eficiente pues la impresión 3D es efectiva para el desarrollo de tendones y cartílagos pero todavía no para órganos más complejos. Sin embargo, el trasplante de un órgano de un cerdo a un ser humano debe superar dos problemas: aumentar la compatibilidad entre el órgano porcino y el organismo humano y eliminar los virus endógenos de los cerdos, que podrían infectar a las células humanas.

Por ejemplo, la OMS ha emitido varios documentos advirtiendo de la amenaza de las infecciones por uno de estos virus, el PERV.

Para solucionar estos problemas, a través del CRISPR se introducen genes humanos en el genoma porcino en la fase embrionaria y han dado lugar a corazones y riñones de cerdos “humanizados” que han mantenido con vida a primates durante meses e incluso años. Se han introducido 25 modificaciones a fin de eliminar la amenaza del PERV y en 2017 nacieron los primeros cerdos sin este virus.

El CRISPR también se podría aplicar a células embrionarias o gametos de la misma forma que a las células adultas. Por ejemplo, científicos de EEUU, Corea del Sur y China buscaron combatir la miocardiopatía hipertrófica, una enfermedad del corazón que provoca muerte súbita en deportistas y personas jóvenes. Una de sus causas principales se encuentra en una copia errónea del gen MYBPC3. Los investigadores inyectaron al mismo tiempo los espermatozoides y una secuencia de CRISPR con la versión correcta del en óvulos donados por mujeres sanas. El 72% de los embriones se desarrolló sin la mutación.

Sin embargo, dado que ninguno de estos estaba destinado a ser implantado, fueron destruidos tras la investigación.

Las limitaciones y peligros del CRISPR

A pesar de su tremendo potencial y eficiencia, el CRISPR es un sistema que tiene limitaciones muy importantes que deben tenerse en cuenta.

Para comenzar, se basa en un instrumento biológico de destrucción, una rotura en una doble hebra que a menudo no puede repararse sin un daño permanente. Esta propiedad puede ser útil para inutilizar genes, pero también supone un riesgo.

Una forma de evitar estos daños en las últimas variables de CRISPR-Cas9 ha sido cortar una sola hebra del ADN, lo que reduce considerablemente los indeles en lugares no deseados y mejora la precisión.

Tampoco se pueden evitar del todo los cambios no deseados en el sistema CRISPR-Cas9.

Existe un problema de que, pese a que puede cortar con precisión una ubicación definida del genoma, necesita que la proximidad exista una secuencia de genes específica que no puede seleccionarse a voluntad.

Además, la maquinaria del CRISPR-Cas9 es muy voluminosa, por lo que es difícil introducirla en las primeras células embrionarias de los mamíferos, cuyos transportadores genéticos no pueden con ellas, por lo que debe inyectarse directamente, lo que limita la eficacia.

Pero probablemente el problema más importante está en la eficacia de la técnica de edición genética y es que incluso en las técnicas más eficaces las probabilidades de que el proceso actúe de forma deseada es relativamente baja. Por ejemplo, en las células madre humanas pluripotentes inducidas, la eficacia del CRISPR-Cas9 es del 2 a 5%.

En los embriones del pez cebra la probabilidad de éxito está en el 70%, pero este es un mercado muy limitado.

¿Y qué pasa con el 95% de casos en que el sistema no da los resultados apetecidos? Sucede un fenómeno conocido como “ruido genético”, en el cual los sistemas de reparación del ADN de la célula realizan una reparación ineficiente del genoma causando modificaciones indeseables potencialmente dañinas.

En este sentido, podemos introducir las herramientas de edición directamente dentro del cuerpo del paciente (terapia in vivo), lo que es poco prudente. La otra posibilidad está en extraer células del paciente, de su sangre por ejemplo, y editarlas en laboratorio. Tras ser validadas y verificadas, las células son incorporadas de nuevo al cuerpo del paciente. Este proceso se conoce como terapia ex vivo y se considera más seguro.

Las niñas del CRISPR

A finales de noviembre de 2018 el CRISPR, que aunque conocido entre investigadores era desconocido por el gran público (y por mí también, lo reconozco, la genética no es mi especialidad) se coló en los medios de todo el mundo acaparando titulares, lugar en las tertulias y comentarios en redes sociales.

¿Qué había sucedido? Pues que He Jiankui, experto en edición genética de la Universidad Meridional de Ciencia y Tecnología de China, anunció el nacimiento de los primeros seres humanos editados genéticamente: dos niñas gemelas cuyos embriones había modificado con el CRISPR-Cas9 y a las que seguiría una tercera nacida en primavera de 2019.

Tal anuncio tuvo lugar a través de un vídeo de Youtube. Del 27 al 29 de ese mismo mes estaba anunciada la segunda cumbre internacional sobre la edición genética en humanos en Hong-Kong, entre cuyo ponentes estaba el propio He Jiankui el día 28 y había anticipado a los organizadores que hablaría de sus resultados in vitro editando embriones de primates y humanos.

Sus palabras tuvieron un enorme seguimiento e incluso recibieron el respaldo de su gobierno. La siguió un manuscrito publicado por He en internet.

¿Qué fue lo que hizo He?

La modificación del genoma planteada por He consistió en la inactivación a través de las tijeras CRISPR-Cas9 de un gen llamado CCR5, que codifica una proteína que permite la entrada del VIH en las células.

El experto en edición genética Fyodor Urnov afirmó en MIT Technology Review que “Los datos que examiné indican que la edición sí tuvo lugar”.

Según parece, la madre de las niñas estaba sana pero el padre era portador de VIH y He Jiankui engañó a las parejas haciéndoles creer que el tratamiento con CRISPR para inactivar el gen CCR5 era el único posible para evitar que sus hijos se infectaran con el VIH y desarrollaran SIDA para luego engañar a sus colegas ginecólogos para que implantaran los embriones editados genéticamente editados pretendiendo que solo había realizado un procedimiento de fecundación in vitro normal.

Fueron unos actos deshonestos: el tratamiento recomendado en estos casos consiste en una fecundación in vitro previo lavado del esperma para eliminar todo rastro del VIH (procedimiento que He afirma haber utilizado).

Urnov también afirmó que existen “maneras seguras y eficaces” de aplicar la genética para proteger a los pacientes con VIH que no implican la edición del genoma de un embrión.

Paula Cannon, quien estudia el VIH en la Universidad del Sur de California, también cuestionó la decisión de He, señalado que algunas cepas de VIH ni siquiera utilizan la proteína del CCR5 para entrar, sino que se sirven de la llamada proteína CXCR4. Incluso las personas que carecen naturalmente de la proteína CCR5 no son completamente inmunes al SIDA.

La comunidad científica condenó el experimento de He casi al unísono con solo algunas excepciones como la de Gerge Church de Harvard.

La Universidad Meridional de Ciencia y Tecnología comunicó el 26 de noviembre que desconocía los experimentos de He y que estos no tuvieron lugar en sus instalaciones, señalando que exige que las investigaciones cumplan con las leyes y normas nacionales y respeten la ética internacional.

Más de 100 investigadores biomédicos chinos publicaron una declaración en línea en la que condenaron las afirmaciones de He y pidieron a las autoridades chinas que investigaran el caso.

Lluís Montoliu, en un reciente artículo en The Conversation, ha descrito el experimento como irresponsable (cosa fácil de comprender si tenemos en cuenta las limitaciones del CRISPR) y afirma que He Jiankui tenía la “ensoñación mesiánica de pretender generar una estirpe de niños y niñas inmunes al SIDA”.

Aunque en un primer momento el gobierno chino aplaudió las acciones de He, en unas horas cambió su postura y a finales de 2019, tras meses sin conocer su situación, se supo que He Jiankui fue condenado por las autoridades chinas a penas económicas, de cárcel e inhabilitación para él y sus colaboradores más directos.

¿Qué fue de las niñas?

La información de que disponemos es limitada. A las gemelas se las ha conocido con los apodos de Lulu y Nana, que no son sus nombres reales (de hecho, parecen nombres de oso panda) se las ha descrito como famosas y víctimas.

He Jiankui había prometido a los padres un seguimiento médico de las niñas hasta que cumplieran los 18 años y las autoridades chinas se han comprometido a monitorizar de cerca a estas tres niñas hasta los 5 años.

La información trascendida de estos estudios da a entender que ninguna de las tres niñas reprodujo la deleción de forma natural en el gen CCR5 (delta32) que bloquea la función del correceptor e impide la entrada de VIH en los linfocitos.

Las personas que presentan delta32 en homocigosis son inmunes a la forma natural del VIH. “Lulu” tenía un alelo modificado mientras otro parecía estar intacto y funcional. “Nana” parecía sí tener ambos alelos modificados (adición de un par de bases en uno y deleción de cuatro pares en otro).

Parece que las tres niñas son “mosaicos” y que no todas sus células han sido editadas, por lo que la llamada Nana seguiría siendo infectable.

Y la tercera niña solo tenía editado un alelo.

Por último, parece que se ha detectado una “alteración genómica no deseada” en el genoma de la llamada Lulu.

En general, el experimento de He Jiankui podría definirse como irresponsable, arrogante, deshonesto e infructuoso.

El tiempo dirá cómo es la vida de estas “niñas CRISPR”.

Consideraciones sobre el CRISPR

Sobre el futuro y aplicación del CRISPR, ya he mencionado a lo largo de la entrada que sus potenciales son enormes, aunque también tiene muchas complicaciones todavía.

Sobre su aplicación voy a comentar dos consideraciones de Lluís Montoliu:

  • Aumentar capacidades como la inteligencia está todavía lejos, pero de llegar podría llevar a problemas de eugenesia, que se sabe cómo pueden comenzar pero no como terminan.
  • Sobre el tratamiento con embriones, considera que existen millones de personas con enfermedades raras expulsadas de los sistemas de salud y que es “éticamente irresponsable” pensar ene embriones, personas potenciales, que en personas actuales.

Según Montoliu, los primeros beneficiarios serán los adultos.

También debemos tener en cuenta que existen luchas de patentes privadas y numerosas regulaciones desfavorables.

Pero, Montoliu también considera que hay motivos para tener esperanzas en el CRISPR.

En mi opinión, el CRISPR es una metodología muy interesante para la edición genética con fines sanitarios, alimentarios y ecológicos. Requiere más desarrollo, pero podría ayudar a mucha gente.

Bibliografía:

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